二硫鍵上的定點修飾

 

    很多蛋白質中半胱氨酸都是以二硫鍵的形式存在，將二硫鍵還原為兩個游離的巰基，再用雙反應性的聚乙二醇化試劑進行修飾，可形成一種三碳橋結構（如圖），能替代二硫鍵起穩(wěn)定修飾產物空間結構的作用，對活性影響很小。用該方法修飾干擾素 α-2b（IFN）時，發(fā)現修飾產物 PEG-IFN 的生物活性與 PEG 的長度無關，比其他位點的聚乙二醇修飾收率高，成本低。抗原結合片段（Fab）在血液循環(huán)中迅速消除，是聚乙二醇化修飾的良好對象。Khalili 等合成了PEG-雙砜試劑，能特異性地將二硫鍵末梢定位到 Fab 的結合區(qū)。對貝伐珠單抗、雷珠單抗、曲妥珠單抗等水解得到的 Fab 進行 PEG 化，離子交換色譜純化后得到純的 PEG-Fab 產品，十二烷基*聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）未檢測到 PEG 損失。用表面等離子體共振（SPR）進行比較結果研究表明：（1）Fab 和用于定點聚乙二醇修飾的 PEG 雙烷基化試劑匹配良好；（2）PEG-Fab 只在表面親和力下降了 2 倍，而解離速率沒有任何變化；（3） PEG 相對分子質量變化時，表面結合速率和親和力保持不變。

 

單點突變引入巰基后的修飾

 

    何燕等將比伐盧定（BVLD）多肽鏈 7-甘氨酸（Gly）用半胱氨酸（Cys）取代，用聚乙二醇定點修飾巰基，采用多肽固相合成法制得 [Cys]7-BVLD，其與不同相對分子質量的 mPEG-MAL 偶聯(lián)合成了 3 個聚乙二醇化比伐盧定衍生物：[Cys(mPEG2000-MAL)]7-BVLD、[Cys(mPEG 5000-MAL)]7-BVLD和[Cys(mPEG10000-MAL)]7-BVLD，這些衍生物的結構經 MS 確證。凝血酶原時間和凝血酶時間評價結果表明，3 個衍生物均表現出良好的抗凝活性，尤其是[Cys(mPEG5000-MAL)]7-BVLD 的抗凝活性優(yōu)于比伐盧定。

    安群星等選擇天花粉蛋白（TCS）分子上可能的抗原決定簇位點 KR173-174 進行定點突變，并將所構建的突變體 TCS KR173-174 在大腸桿菌中表達及純化。通過該突變體第 173 位引入的半胱氨酸殘基進行 PEG 定點修飾。結果表明，所構建的突變型 TCS（mTCS）的活性與野生型 TCS（wTCS）活性相當，而免疫原性已顯著降低。PEG 修飾型 TCS 雖活性稍低，但其免疫原性、急性毒性以及藥動學性質得到顯著提升。表明通過基因工程及化學修飾方法改造 TCS 可行，所構建的突變型及 PEG 修飾型 TCS 值得進一步研究。

    黃湘鷺等利用蛋白質分子同源模建，選擇在集成干擾素分子 IIFN 的第 72 位引入半胱氨酸殘基構成集成干擾素突變體 IIFN72C。誘導表達后經包涵體變復性和柱色譜純化，與 mPEG-MAL 定點偶聯(lián)。結果表明，IIFN72C 以包涵體形式表達，表達量占菌體總蛋白的 30%以上，比活性與突變前相當，修飾產物大多數為單修飾體，純化后質量分數大于98%，比活性保留約為修飾前的 8%。

   治療嚴重痛風的一種方法是注射非人類尿激酶，以減少體內尿酸水平。pegloticase 是一種聚乙二醇化的豬–狒狒嵌合尿激酶，用于慢性難治性痛風，但會產生較多的過敏反應，此外，還有一些皮膚紅腫、便秘、胸痛和嘔吐等副反應，這些限制了它的應用和效果。Nyborg 等^[16]研制了一種治療性的尿激酶，在 200 個代表不同 HLA 單體的人體樣本中，免疫原性較低，將半胱氨酸設計到該序列中，用聚乙二醇定點修飾，效率能達到 95%。聚乙二醇尿激酶在體外，中性 pH 值條件下，在人體血漿中以及鼠類和犬類體內的酶活性保持不變。在犬身上，皮下注射能使血漿中尿酸水平降低 85%。這種聚乙二醇化的非免疫原性尿激酶將為痛風患者帶來極大的幫助。

    葡激酶（SAK）是一種細菌來源的、具有良好靶向性和溶栓活性的蛋白，擁有極大應用潛力，但在生物體內產生嚴重免疫反應，血漿半衰期短（僅3min）。根據 SAK 晶體結構及抗原位點選擇突變位點，構建突變質粒，并在大腸桿菌中表達半胱氨酸（Cys）突變蛋白 S-cys；對目的蛋白在不同條件下進行聚乙二醇修飾^[17]，純化后得到較高純度的修飾蛋白 PEG-S-cys，通過纖維蛋白平板溶圈實驗和動物栓塞模型的構建初步對其生物活性進行驗證。結果表明所得 PEG-S-cys 蛋白質量分數大于 90%， PEG-S-cys 具有溶栓活性，這為葡激酶的改造提供了一種新的方法與思路。

 

多點突變引入巰基后的修飾

 

    梁凌宇等采用分子生物學技術經點突破得到rhCNTF 突變體 CN10，運用 mPEG-MAL 對 CN10進行定點修飾，每 2 天 ip 一次 PEG 化的 CN10，對小鼠體質量的增長抑制率可達 50%，與每天注射 2次rhCNTF 的體質量增長抑制作用相當，說明 CN10蛋白在 PEG 化修飾后，其減重效應持續(xù)時間可明顯延長。馮翠等則采用 mPEG-MAL 對 rhCNTF 的第 17 位半胱氨酸巰基進行定點修飾，實驗結果表明，在 pH 7.5 的 Tris-HCl 緩沖溶液中，蛋白質與修飾劑的比例為 1∶3，4 ℃下反應 12 h，修飾率可達到90%以上，修飾混合物通過一步陰離子交換色譜可獲得質量分數 98%以上的單修飾產物。熒光光譜和圓二色圖譜顯示 mPEG-CNTF-C17 與原蛋白二、三級結構一致。細胞增殖活性檢測表明，mPEG-CNTF-C17 的比活達到了 6.51×10⁵ IU/mg，體內循環(huán)半衰期相對原蛋白提高了 30.3 倍。該研究為開發(fā) CNTF 長效產品提供了基礎。

    為獲得高抗菌活性聚乙二醇定點修飾的溶葡萄球菌酶（Lysn），根據該酶的結構，在它的催化域和結合域上優(yōu)選 8 個位點（Q9、N13、N40、T172、N174、G197、V240 和 T244），分別突變成半胱氨酸，純化后的溶葡萄球菌酶突變體經二硫蘇糖醇（DTT）處理后與 mPEG-MAL 進行定點修飾反應，RP-HPLC 分析顯示 PEG 修飾率大于 70%，修飾產物經 MacroCapSP 陽離子交換層析純化后，PEG 化溶葡萄球菌酶的質量分數大于 95%。比濁法和小抑菌濃度（MIC）實驗表明 20K-PEG-LysnV240C和20K-PEG-LysnT244C 的抗菌活性維持在原來的50%左右。研究結果為溶葡萄球菌酶全身給藥治療金黃色葡萄球菌感染奠定了基礎。

 

通過 Traut 試劑引入巰基后的修飾

 

    為了構建 trastuzumab（TMAB）–聚乙二醇–PARAM 靶向遞藥系統(tǒng)，馬鵬凱等以雙功能聚乙二醇為連接子，并在 trastuzumab 上通過 Traut 試劑引入巰基。通過琥珀酸酐共價連接在 PAMAM 表面，由于酯鍵比較穩(wěn)定，藥物緩慢釋放；隨后再在PAMAM 表面共價結合雙功能聚乙二醇 NHS-PEG-MAL，延長其在血液循環(huán)的時間，增強 EPR 效應，提高藥物在腫瘤部位的濃度，后 PEG 末端連接巰基化的 TMAB，利用與 HER2 受體的作用提高進入腫瘤細胞的藥物濃度，達到持續(xù)、有效、安全的腫瘤治療策略。